Ditiotreitol (DTT) je pogosto uporabljen reducent, znan tudi kot novi zeleni aditiv.Je organska spojina majhne molekule z dvema merkaptanskima skupinama (-SH).Zaradi redukcijskih lastnosti in stabilnosti se DTT pogosto uporablja v biokemiji in poskusih molekularne biologije.
Glavna vloga DTT je zmanjšati disulfidne vezi v beljakovinah in drugih biomolekulah.Disulfidna vez je pomemben del zvijanja in stabilnosti proteinov, vendar je pod določenimi eksperimentalnimi pogoji, kot je redukcijska analiza SDS-PAGE, rekombinacija in zvijanje proteinov, potrebno reducirati disulfidno vez na dve tiolni skupini, da razkrijemo prostorsko strukturo beljakovine.DTT lahko reagira z disulfidnimi vezmi, da jih reducira v merkaptanske skupine, s čimer odpre prostorsko strukturo proteina in olajša analizo in manipulacijo.
DTT se lahko uporablja tudi za zaščito aktivnosti in stabilnosti encimov.Pri nekaterih encimsko kataliziranih reakcijah lahko oksidant zmanjša aktivnost encima.DTT lahko reagira z oksidanti in jih reducira v neškodljive snovi ter tako zaščiti aktivnost in stabilnost encima.
V primerjavi s tradicionalnimi redukcijskimi sredstvi, kot je β-merkaptoetanol (β-ME), velja DTT za varnejše in stabilnejše redukcijsko sredstvo.Ni samo stabilen v vodni raztopini, ampak tudi ohranja svoje redukcijske lastnosti pri visoki temperaturi in kislinsko-bazičnih pogojih.
Uporaba DTT je razmeroma preprosta.Na splošno se DTT raztopi v ustreznem pufru in nato doda poskusnemu sistemu.Optimalno koncentracijo DTT je treba določiti v skladu s posebnim poskusom in se običajno uporablja v območju 0,1–1 mM.Nižje koncentracije lahko zmanjšajo škodljive učinke na rast celic in lahko zmanjšajo citotoksičnost zaradi prekomerne ekspresije ciljnih proteinov.Višje koncentracije lahko povzročijo čezmerno presnovno obremenitev celic, kar vpliva na celično rast in učinkovitost izražanja.
Način za določitev optimalne koncentracije je lahko ovrednotenje stopnje izražanja ciljnega proteina z izvajanjem indukcijskih testov IPTG pri različnih koncentracijah.Preskuse kulture v majhnem obsegu je mogoče izvesti z uporabo razpona koncentracij IPTG (npr. 0,1 mM, 0,5 mM, 1 mM itd.), učinek izražanja pri različnih koncentracijah pa je mogoče ovrednotiti z zaznavanjem ravni izražanja ciljnega proteina (npr. Western blot ali fluorescenčna detekcija).Glede na eksperimentalne rezultate je bila koncentracija z najboljšim ekspresijskim učinkom izbrana kot optimalna koncentracija.
Poleg tega se lahko obrnete tudi na ustrezno literaturo ali izkušnje drugih laboratorijev, da razumete pogosto uporabljeno območje koncentracije IPTG v podobnih eksperimentalnih pogojih ter nato optimizirate in prilagodite glede na eksperimentalne potrebe.
Pomembno je omeniti, da se optimalna koncentracija lahko razlikuje glede na različne ekspresijske sisteme, ciljne beljakovine in eksperimentalne pogoje, zato je najbolje, da optimizirate za vsak primer posebej.
Če povzamemo, DTT je pogosto uporabljeno redukcijsko sredstvo, ki se lahko uporablja za zmanjšanje disulfidnih vezi v beljakovinah in drugih biomolekulah ter za zaščito aktivnosti in stabilnosti encimov.Veliko se uporablja v biokemiji in poskusih molekularne biologije.
Čas objave: 28. septembra 2023