Ditiotreitol (DTT) je pogosto uporabljeno redukcijsko sredstvo, znano tudi kot novi zeleni aditiv. Je organska spojina z majhno molekularno maso in dvema merkaptanskima skupinama (-SH). Zaradi svojih redukcijskih lastnosti in stabilnosti se DTT pogosto uporablja v biokemičnih in molekularno-bioloških poskusih.
Glavna vloga DTT je zmanjšanje disulfidnih vezi v beljakovinah in drugih biomolekulah. Disulfidna vez je pomemben del zvijanja in stabilnosti beljakovin, vendar je pod določenimi eksperimentalnimi pogoji, kot so analiza reducibilne SDS-PAGE, rekombinacija in zvijanje beljakovin, potrebno reducirati disulfidno vez na dve tiolni skupini, da se razkrije prostorska struktura beljakovine. DTT lahko reagira z disulfidnimi vezmi in jih reducira v merkaptanske skupine, s čimer odpre prostorsko strukturo beljakovine in jo olajša pri analizi in manipulaciji.
DTT se lahko uporablja tudi za zaščito aktivnosti in stabilnosti encimov. Pri nekaterih encimsko kataliziranih reakcijah lahko oksidant zmanjša aktivnost encima. DTT lahko reagira z oksidanti in jih reducira v neškodljive snovi, s čimer zaščiti aktivnost in stabilnost encima.
V primerjavi s tradicionalnimi redukcijskimi sredstvi, kot je β-merkaptoetanol (β-ME), velja DTT za varnejše in stabilnejše redukcijsko sredstvo. Ni stabilen le v vodni raztopini, temveč ohranja svoje redukcijske lastnosti tudi pri visoki temperaturi in kislinsko-bazičnih pogojih.
Uporaba DTT je relativno preprosta. Na splošno se DTT raztopi v ustreznem pufru in nato doda v eksperimentalni sistem. Optimalno koncentracijo DTT je treba določiti glede na specifičen poskus in se običajno uporablja v območju 0,1–1 mM. Nižje koncentracije lahko zmanjšajo neželene učinke na rast celic in citotoksičnost zaradi prekomerne ekspresije ciljnih beljakovin. Višje koncentracije lahko povzročijo prekomerno presnovno obremenitev celic, kar vpliva na rast celic in učinkovitost ekspresije.
Optimalno koncentracijo lahko določimo z oceno ravni izražanja ciljnega proteina z izvajanjem indukcijskih testov IPTG pri različnih koncentracijah. Teste v majhnih kulturah je mogoče izvesti z uporabo različnih koncentracij IPTG (npr. 0,1 mM, 0,5 mM, 1 mM itd.), učinek izražanja pri različnih koncentracijah pa je mogoče oceniti z zaznavanjem ravni izražanja ciljnega proteina (npr. Western blot ali fluorescenčna detekcija). Glede na eksperimentalne rezultate je bila kot optimalna koncentracija izbrana koncentracija z najboljšim učinkom izražanja.
Poleg tega se lahko sklicujete tudi na ustrezno literaturo ali izkušnje drugih laboratorijev, da bi razumeli pogosto uporabljeno območje koncentracij IPTG v podobnih eksperimentalnih pogojih, nato pa ga optimizirate in prilagodite glede na eksperimentalne potrebe.
Pomembno je omeniti, da se optimalna koncentracija lahko razlikuje glede na različne ekspresijske sisteme, ciljne beljakovine in eksperimentalne pogoje, zato jo je najbolje optimizirati za vsak primer posebej.
Skratka, DTT je pogosto uporabljeno redukcijsko sredstvo, ki se lahko uporablja za zmanjšanje disulfidnih vezi v beljakovinah in drugih biomolekulah ter za zaščito aktivnosti in stabilnosti encimov. Široko se uporablja v biokemičnih in molekularno-bioloških poskusih.
Čas objave: 28. september 2023