Okoli nas je veliko neopevanih junakov, ki se zdijo navadni, a nam v resnici na tihem veliko prispevajo.Proteinaza K je "neopevani junak" v industriji molekularne diagnostike, čeprav je v primerjavi z "velikimi in močnimi" v industriji proteinaza K tako skromna, da smo dolgo spregledali njen pomen.Z izbruhom nove kronske epidemije se je povpraševanje po proteinazi K močno povečalo, ponudba doma in v tujini pa močno zaostaja za porabo in vsi so nenadoma spoznali, da je proteinaza K tako pomembna.
Kakšna je uporaba proteinaze K?
Proteinaza K je serinska proteaza s proteolitično encimsko aktivnostjo in lahko ohranja aktivnost v širokem razponu okolij (pH (4-12,5), pufer z visoko vsebnostjo soli, visoka temperatura 70 °C itd.).Poleg tega aktivnosti proteinaze K ne zavirajo SDS, sečnina, EDTA, gvanidin hidroklorid, gvanidin izotiocianat itd., določena količina detergenta pa lahko poveča tudi aktivnost proteinaze K. Pri zdravljenju (dezinfekcija virusov in mikrobov ), prehrana (mehčanje mesa), usnje (mehčanje dlak), vinarstvo (bistrenje z alkoholom), priprava aminokislin (razgrajeno perje), ekstrakcija nukleinske kisline, in situ hibridizacija itd., proteinaza K Obstajajo aplikacije.Najpogosteje uporabljena aplikacija je ekstrakcija nukleinske kisline.
Proteinaza K lahko encimolizira vse vrste beljakovin v vzorcu, vključno s tistimi histoni, ki so tesno vezani na nukleinske kisline, tako da se lahko nukleinske kisline sprostijo iz vzorca in sprostijo v ekstrakt, kar olajša naslednji korak ekstrakcije in čiščenja.Pri odkrivanju virusne nukleinske kisline je proteinaza K ena od pomembnih komponent v raztopini za vzorčenje virusa.Proteinaza K lahko razbije in inaktivira ovojni protein virusa, kar je varnejše v fazi transporta in odkrivanja;poleg tega lahko proteinaza K tudi razgradi RNazo preprečuje razgradnjo virusne RNA in olajša odkrivanje nukleinske kisline.
Slava proteinaze K
Ne glede na to, ali je na področju znanstvenih raziskav ali na področju IVD, je ekstrakcija nukleinske kisline najosnovnejši eksperiment, zato je bila proteinaza K vedno zelo pomembna.Vendar je bila v preteklosti proteinaza K veliko manj znana kot njena vloga.Velik del tega je bilo zato, ker je bilo razmerje med ponudbo in povpraševanjem po proteinazi K zelo stabilno.Malokdo bi pomislil, da bi bila oskrba s proteinazo K problem.
Z izbruhom nove kronske epidemije se je povpraševanje po testiranju nukleinske kisline povečalo.Do konca junija 2020 je Kitajska opravila skoraj 90 milijonov novih kronskih testov in ta številka je še bolj zaskrbljujoča v svetovnem merilu.Pri poskusih ekstrakcije nukleinske kisline je delovna koncentracija proteinaze K približno 50-200 μg/mL.Na splošno je za ekstrakcijo vzorca nukleinske kisline potrebnih približno 100 μg proteinaze K.Pri dejanski uporabi se bo za povečanje učinkovitosti ekstrakcije nukleinske kisline pogosto uporabljala povečana količina proteinaze K.Odkrivanje nukleinske kisline novega koronavirusa je povzročilo veliko povpraševanje po proteinazi K.Prvotno ravnovesje med ponudbo in povpraševanjem po proteinazi K je bilo hitro porušeno in proteinaza K je čez noč postala pomemben material za preprečevanje epidemije.
Težave pri proizvodnji proteinaze K
Čeprav so z razvojem epidemije ljudje ovrednotili pomembno vrednost proteinaze K, je neprijetno, da je zaradi pretirane skromnosti proteinaze K malo domačih podjetij vključenih v proizvodnjo proteinaze K. Ko ljudje želijo vzpostaviti proizvodnjo proteinaze K Med proizvodnim procesom so ugotovili, da je proteinaza K izjemno posebna beljakovina.V kratkem času je izjemno zahtevno razširiti proizvodno zmogljivost proteinaze K.
Obsežna proizvodnja proteinaze K se sooča z naslednjimi težavami
1. Nizko izražanje
Proteinaza K lahko nespecifično razgradi večino beljakovin in povzroči resno toksičnost ekspresijske gostiteljske celice.Zato je raven izražanja proteinaze K na splošno zelo nizka.Preverjanje ekspresijskih sistemov in sevov, ki močno izražajo proteinazo K, običajno zahteva daljši cikel.
2. Ostanki pigmentov in nukleinskih kislin
Obsežna fermentacija vnese veliko količino pigmenta in ostankov gostiteljske nukleinske kisline.Te nečistoče je težko odstraniti s preprostim postopkom čiščenja, zapleteno čiščenje pa poveča stroške in zmanjša stopnjo predelave.
3. Nestabilnost
Proteinaza K ni dovolj stabilna, lahko se encimolizira in jo je težko dolgo časa stabilno hraniti pri 37°C brez zaščitnega sredstva.
4. Enostaven za obarjanje
Pri pripravi liofiliziranega prahu proteinaze K, da bi zagotovili, da je trdna vsebnost proteinaze K v liofiliziranem prašku velika, je treba dodati liofilizirano zaščitno sredstvo v visoki koncentraciji, ko pa koncentracija proteinaze K doseže 20 mg/ml in več, je enostavno. Združevanje tvori oborino, kar povzroča velike težave pri sušenju z zamrzovanjem proteinaze K z visoko vsebnostjo trdnih snovi.
5. Velika naložba
Proteinaza K ima močno proteazno aktivnost in lahko hidrolizira druge proteaze v laboratoriju.Zato proteinaza K zahteva specializirane proizvodne prostore, opremo in osebje za raziskave in razvoj ter proizvodnjo.
XD BIOCHEM-ova raztopina proteinaze K
XD BIOCHEM ima zrelo platformo za izražanje in čiščenje beljakovin ter bogate izkušnje z izražanjem in čiščenjem rekombinantnih proteinov ter optimizacijo proizvodnih procesov.S hitrim oblikovanjem raziskovalne in razvojne ekipe je bil premagan obsežen proizvodni proces proteinaze K.Mesečna proizvodnja liofiliziranega prahu je več kot 30 kg.Izdelek ima stabilno delovanje, visoko encimsko specifično aktivnost in nima ostankov gostiteljskega citokroma in nukleinskih kislin.Dobrodošli v stiku z XD BIOCHEM Pridobite preskusni paket (E-pošta:sales@xdbiochem.comTel.: +86 513 81163739).
Tehnične rešitve XD BIOCHEM vključujejo
Z integracijo plazmidov z več kopijami se izberejo visoko ekspresijski sevi s stopnjo ekspresije 8g/L, kar premaga problem nizke stopnje ekspresije proteinaze K.
Z vzpostavitvijo večstopenjskega postopka čiščenja so bili ostanki gostiteljskega citokroma in nukleinske kisline proteinaze K uspešno odstranjeni pod standardno vrednostjo.
Z visoko zmogljivim presejanjem formulacij zaščitnega pufra je bil izbran pufer, ki lahko stabilno shrani proteinazo K pri 37 °C.
Presejalni pufri premagajo težavo, da je proteinazo K enostavno agregirati in oboriti pri visokih koncentracijah, in postavljajo temelje za liofilizacijo proteinaze K z visoko vsebnostjo trdnih snovi.
XD BIOCHEM vzorec proteinaze K
XD BIOCHEM test stabilnosti proteinaze K: po 80 dneh pri sobni temperaturi ne bo pomembnejše spremembe aktivnosti
XD BIOCHEM test stabilnosti proteinaze K: po 80 dneh pri sobni temperaturi ne bo pomembnejših sprememb v aktivnosti.
Primerjava učinka ekstrakcije nukleinske kisline XD BIOCHEM proteinaze K in konkurenčnih izdelkov.V procesu ekstrakcije nukleinske kisline uporabljamo XD BIOCHEM oziroma kompetitivno proteinazo K.Učinkovitost ekstrakcije XD BIOCHEM proteinaze K je večja, vrednost Ct ciljnega gena pa nižja.
Čas objave: 31. december 2021