Okoli nas je veliko neopevanih junakov, ki se zdijo običajni, a v resnici tiho veliko prispevajo k nam. Proteinaza K je "neopevani junak" v industriji molekularne diagnostike, čeprav je v primerjavi z "velikimi in mogočnimi" v industriji tako nizko prepoznavna, da smo dolgo spregledali njen pomen. Z izbruhom nove epidemije koronavirusa se je povpraševanje po proteinazi K močno povečalo, ponudba doma in v tujini pa močno zaostaja za porabo in vsi so nenadoma spoznali, kako pomembna je proteinaza K.
Kakšna je uporaba proteinaze K?
Proteinaza K je serinska proteaza s proteolitično encimsko aktivnostjo in lahko ohranja aktivnost v širokem razponu okolij (pH (4–12,5), pufer z visoko vsebnostjo soli, visoka temperatura 70 °C itd.). Poleg tega SDS, sečnina, EDTA, gvanidin hidroklorid, gvanidin izotiocianat itd. ne zavirajo aktivnosti proteinaze K, določena količina detergenta pa lahko tudi poveča aktivnost proteinaze K. Proteinaza K se uporablja v medicini (dezinfekcija virusov in mikrobov), hrani (mehčanje mesa), usnju (mehčanje las), vinarstvu (bistrenje alkohola), pripravi aminokislin (razgrajeno perje), ekstrakciji nukleinskih kislin, hibridizaciji in situ itd., pri različnih aplikacijah. Najpogosteje uporabljena aplikacija je ekstrakcija nukleinskih kislin.
Proteinaza K lahko encimizira vse vrste beljakovin v vzorcu, vključno s tistimi histoni, ki so tesno vezani na nukleinske kisline, tako da se nukleinske kisline lahko sprostijo iz vzorca in v ekstrakt, kar olajša naslednji korak ekstrakcije in čiščenja. Pri detekciji virusne nukleinske kisline je proteinaza K ena od pomembnih komponent v raztopini za vzorčenje virusa. Proteinaza K lahko razgradi in inaktivira ovojni protein virusa, kar je varnejše med fazo transporta in detekcije; poleg tega lahko proteinaza K razgradi tudi RNaza, ki preprečuje razgradnjo virusne RNK in olajša detekcijo nukleinske kisline.
Čez noč slava proteinaze K
Ne glede na to, ali gre za področje znanstvenih raziskav ali za področje in vitro diagnostike, je ekstrakcija nukleinskih kislin najosnovnejši poskus, zato je bila proteinaza K vedno zelo pomembna. Vendar pa je bila proteinaza K v preteklosti veliko manj znana kot njena vloga. Velik del tega je bil posledica zelo stabilnega razmerja med ponudbo in povpraševanjem po proteinazi K. Le malo ljudi bi pomislilo, da bi bila ponudba proteinaze K problem.
Z izbruhom nove epidemije koronavirusa se je povpraševanje po testiranju nukleinskih kislin močno povečalo. Konec junija 2020 je Kitajska opravila skoraj 90 milijonov novih testov koronavirusa, kar je v svetovnem merilu še bolj zaskrbljujoče. V poskusih ekstrakcije nukleinskih kislin je delovna koncentracija proteinaze K približno 50–200 μg/ml. Na splošno je za ekstrakcijo vzorca nukleinske kisline potrebnih približno 100 μg proteinaze K. V dejanski uporabi se za povečanje učinkovitosti ekstrakcije nukleinskih kislin proteinaza K pogosto uporablja v večjih količinah. Zaznavanje nukleinskih kislin pri novem koronavirusu je povzročilo veliko povpraševanje po proteinazi K. Prvotno ravnovesje med ponudbo in povpraševanjem proteinaze K se je hitro porušilo in proteinaza K je čez noč postala pomemben material za preprečevanje epidemij.
Težave pri proizvodnji proteinaze K
Čeprav so ljudje z razvojem epidemije začeli ceniti pomembno vrednost proteinaze K, je nerodno, da se je zaradi pretirane nizke ponudbe proteinaze K le malo domačih podjetij ukvarjalo s proizvodnjo proteinaze K. Ko ljudje želijo vzpostaviti proizvodnjo proteinaze K Med proizvodnim procesom so ugotovili, da je proteinaza K izjemno poseben protein. Izjemno težko je v kratkem času razširiti proizvodno zmogljivost proteinaze K.
Proizvodnja proteinaze K v velikem obsegu se sooča z naslednjimi težavami
1. Nizka ekspresija
Proteinaza K lahko nespecifično razgradi večino beljakovin in povzroči resno toksičnost za ekspresijsko celico gostitelja. Zato je raven izražanja proteinaze K običajno zelo nizka. Presejanje ekspresijskih sistemov in sevov, ki močno izražajo proteinazo K, običajno zahteva daljši cikel.
2. Ostanki pigmentov in nukleinskih kislin
Obsežna fermentacija vnese veliko količino pigmenta in ostankov nukleinske kisline gostitelja. Te nečistoče je težko odstraniti s preprostim postopkom čiščenja, kompleksno čiščenje pa poveča stroške in zmanjša stopnjo izkoristka.
3. Nestabilnost
Proteinaza K ni dovolj stabilna, lahko se sama encimizira in jo je težko stabilno shranjevati pri 37 °C dlje časa brez zaščitnega sredstva.
4. Enostavno oborino
Pri pripravi liofiliziranega praška proteinaze K je treba za zagotovitev visoke vsebnosti trdnih snovi v liofiliziranem prašku dodati liofilizirano zaščitno sredstvo v visoki koncentraciji, vendar ko koncentracija proteinaze K doseže 20 mg/ml ali več, se zlahka tvori oborina, kar povzroča velike težave pri liofilizaciji proteinaze K z visoko vsebnostjo trdnih snovi.
5. Velika naložba
Proteinaza K ima močno proteazno aktivnost in lahko v laboratoriju hidrolizira druge proteaze. Zato proteinaza K zahteva specializirana proizvodna območja, opremo in osebje za raziskave, razvoj in proizvodnjo.
Raztopina proteinaze K podjetja XD BIOCHEM
XD BIOCHEM ima zrelo platformo za izražanje in čiščenje beljakovin ter bogate izkušnje z izražanjem in čiščenjem rekombinantnih beljakovin ter optimizacijo proizvodnih procesov. S hitro ustanovitvijo raziskovalne in razvojne ekipe je bil premagan obsežen proizvodni proces proteinaze K. Mesečna proizvodnja liofiliziranega prahu je več kot 30 kg. Izdelek ima stabilno delovanje, visoko specifično encimsko aktivnost in ne vsebuje ostankov gostiteljskega citokroma in nukleinskih kislin. Vljudno vas vabimo, da se obrnete na XD BIOCHEM. Pridobite poskusni paket (e-pošta:sales@xdbiochem.comTel.: +86 513 81163739).
Tehnične rešitve podjetja XD BIOCHEM vključujejo
Z uporabo integracije več kopij plazmidov so izbrani sevi z visoko ekspresijo in stopnjo ekspresije 8 g/L, kar premaga problem nizke stopnje ekspresije proteinaze K.
Z vzpostavitvijo večstopenjskega postopka čiščenja so bili ostanki gostiteljskega citokroma in nukleinske kisline proteinaze K uspešno odstranjeni pod standardno vrednostjo.
Z visokozmogljivim presejanjem formulacij zaščitnih pufrov je bil izbran pufer, ki lahko stabilno shranjuje proteinazo K pri 37 °C.
Presejalni pufri premagajo težavo, da se proteinaza K pri visokih koncentracijah zlahka agregira in obori, ter postavijo temelje za liofilizacijo proteinaze K z visoko vsebnostjo trdnih snovi.
Vzorec proteinaze K XD BIOCHEM
Test stabilnosti proteinaze K XD BIOCHEM: po 80 dneh pri sobni temperaturi ne bo bistvene spremembe aktivnosti.
Test stabilnosti proteinaze K XD BIOCHEM: po 80 dneh pri sobni temperaturi ne bo bistvene spremembe aktivnosti.
Primerjava učinka ekstrakcije nukleinskih kislin s proteinazo K XD BIOCHEM in konkurenčnimi produkti. V procesu ekstrakcije nukleinskih kislin se uporabljata proteinaza K XD BIOCHEM oziroma konkurenčna proteinaza K. Učinkovitost ekstrakcije proteinaze K XD BIOCHEM je višja, vrednost Ct ciljnega gena pa nižja.
Čas objave: 31. dec. 2021