IPTG (izopropil-β-D-tiogalaktozid) je analog substrata β-galaktozidaze, ki je zelo inducibilen. Pri indukciji IPTG lahko induktor tvori kompleks z represorskimi proteini, tako da se konformacija represorskih proteinov spremeni, tako da se ne morejo kombinirati s ciljnim genom in se ciljni gen učinkovito izraža. Kako torej določiti koncentracijo IPTG med poskusom? Ali je večja, tem boljša?
Najprej si poglejmo načelo indukcije IPTG: Laktazni operon (element) E. coli vsebuje tri strukturne gene, Z, Y in A, ki kodirajo β-galaktozidazo, permeazo in acetiltransferazo. lacZ hidrolizira laktozo v glukozo in galaktozo oziroma v alo-laktozo; lacY omogoča, da laktoza v okolju prehaja skozi celično membrano in vstopi v celico; lacA prenese acetilno skupino iz acetil-CoA v β-galaktozid, kar vključuje odstranitev toksičnega učinka. Poleg tega obstaja operativno zaporedje O, začetno zaporedje P in regulatorni gen I. Koda gena I je represorski protein, ki se lahko veže na položaj O operatorskega zaporedja, tako da se operon (meta) potlači in izklopi. Pred začetnim zaporedjem P je tudi vezavno mesto za vezavno mesto CAP za katabolični aktivatorski protein gena. Zaporedje P, zaporedje O in vezavno mesto CAP skupaj tvorijo regulatorno regijo lac operona. Kodirne gene treh encimov regulira ista regulatorna regija, da se doseže koordinirana ekspresija genskih produktov.
V odsotnosti laktoze je lac operon (meta) v stanju represije. V tem času se lac represor, ki ga izraža zaporedje I pod nadzorom zaporedja promotorja PI, veže na zaporedje O, kar preprečuje vezavo RNA polimeraze na zaporedje P in zavira začetek transkripcije; ko je prisotna laktoza, se lahko inducira lac operon (meta). V tem operonskem (meta) sistemu pravi induktor ni laktoza sama. Laktoza vstopi v celico in jo katalizira β-galaktozidaza, da se pretvori v alolaktozo. Slednja se kot molekula induktorja veže na represorski protein in spremeni konformacijo proteina, kar vodi do disociacije represorske beljakovine iz zaporedja O in transkripcije. Izopropiltiogalaktozid (IPTG) ima enak učinek kot alolaktoza. Je zelo močan induktor, ki ga bakterije ne presnavljajo in je zelo stabilen, zato se pogosto uporablja v laboratorijih.
Kako določiti optimalno koncentracijo IPTG? Vzemimo za primer E. coli.
Gensko spremenjen sev E. coli BL21, ki je vseboval pozitivni rekombinantni pGEX (CGRP/msCT), je bil inokuliran v tekoči medij LB, ki je vseboval 50 μg·mL-1 Amp, in gojen čez noč pri 37 °C. Zgornja kultura je bila inokulirana v 10 steklenic s 50 ml svežega tekočega medija LB, ki je vseboval 50 μg·mL-1 Amp, v razmerju 1:100 za ekspanzijsko kulturo in ko je bila vrednost OD600 0,6~0,8, je bil do končne koncentracije dodan IPTG. Ta je 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0 mmol·L-1. Po indukciji pri isti temperaturi in istem času smo iz nje odvzeli 1 ml bakterijske raztopine, bakterijske celice pa smo zbrali s centrifugiranjem in jih podvrgli SDS-PAGE, da bi analizirali vpliv različnih koncentracij IPTG na izražanje beljakovin, nato pa izbrali koncentracijo IPTG z največjo ekspresijo beljakovin.
Po poskusih se je izkazalo, da koncentracija IPTG ni čim večja. To je zato, ker ima IPTG določeno toksičnost za bakterije. Presežek koncentracije bo ubil tudi celico; in na splošno velja, da je bolje, če je v celici izražena večja količina topnih beljakovin, vendar se v mnogih primerih, ko je koncentracija IPTG previsoka, tvori velika količina vključkov. To se zgodi, ko je koncentracija IPTG previsoka, vendar se količina topnih beljakovin zmanjša. Zato najprimernejša koncentracija IPTG pogosto ni večja, temveč nižja koncentracija.
Namen indukcije in gojenja gensko spremenjenih sevov je povečati donos ciljnega proteina in zmanjšati stroške. Na izražanje ciljnega gena ne vplivajo le dejavniki, ki jih ima sev, in ekspresijski plazmid, temveč tudi drugi zunanji pogoji, kot so koncentracija induktorja, temperatura indukcije in čas indukcije. Zato je na splošno pred izražanjem in čiščenjem neznanega proteina najbolje preučiti čas indukcije, temperaturo in koncentracijo IPTG, da se izberejo ustrezni pogoji in dosežejo najboljši eksperimentalni rezultati.
Čas objave: 31. dec. 2021